科學除支不損細胞活性，支原體污染清除劑的操作手冊

支原體污染清除劑主要用于細胞培養過程中支原體污染的清除與后續防護。由于不同貨號、批次和使用場景存在差異，具體稀釋倍數、處理時長和保存條件應以隨貨說明書為準。  

使用前準備  

收到試劑后應先核對產品名稱、貨號、規格、批號和有效期。Mynox類試劑通常需低溫保存，使用前按說明書要求融化并避免反復凍融。ZellShield一般建議-18℃左右保存，使用前融化分裝，現用現取。操作應在生物安全柜或超凈臺中進行，穿戴實驗服、手套，必要時佩戴口罩，避免試劑接觸皮膚或吸入氣溶膠。  

處理前建議先確認細胞是否確實存在支原體污染，可采用Hoechst熒光染色、支原體PCR或qPCR檢測等方法。若污染程度較輕、細胞狀態尚可，可嘗試清除；若細胞已大量死亡、貼壁差、增殖嚴重受抑，建議謹慎評估挽救價值，必要時直接丟棄并進行環境消殺，避免污染擴散。  

細胞污染清除的一般流程  

1.貼壁細胞處理  

貼壁細胞可先棄去舊培養基，用PBS輕柔清洗細胞，再加入含清除試劑的新鮮培養基。若采用MynoxGold，應按說明書配制治療液，使細胞與試劑充分接觸，作用結束后換液并進入鞏固防護階段。若采用ZellShield，可在傳代后按推薦比例加入培養基中連續處理。處理期間每2–3天換液一次，并根據細胞密度適時傳代。  

2.懸浮細胞處理  

懸浮細胞可先離心收集細胞，棄去含支原體的舊培養基，再用含清除試劑的新鮮培養基重懸培養。若說明書要求使用胰酶/EDTA輔助分散細胞，應嚴格按推薦濃度和時間操作，避免細胞損傷過大。懸浮細胞與試劑接觸更充分，但也更容易因處理條件過強而損失，需密切觀察細胞活率。  

3.病毒液或生物樣本處理  

對于病毒收獲液、生物樣本等非細胞體系，應優先選擇說明書明確支持該用途的產品。Mynox可用于部分病毒液或樣本中的支原體清除，但需控制作用時間、血清濃度和終止條件。處理后建議通過支原體PCR/qPCR復檢，確認清除效果。  

鞏固處理與效果驗證  

支原體被清除后，培養體系中可能仍殘留支原體核酸，短期內檢測可能出現假陽性，因此不建議在剛結束處理時立即下結論。通常應在清除處理后繼續傳代培養，再使用支原體PCR或qPCR試劑盒復檢。若連續檢測為陰性，可繼續常規培養并定期抽檢；若仍為陽性，應檢查是否處理濃度不足、換液不及時、環境再次污染，或考慮更換清除方案。  

清除期間建議保留部分原始污染細胞作為對照，便于比較細胞狀態和檢測效果。處理結束后，也應至少連續傳代2–4代并多次復檢，確認支原體未復發。  

環境與器具同步處理  

僅處理細胞而不處理環境，容易造成再次污染。超凈臺、培養箱、移液器、門把手、液氮罐、水浴鍋、細胞培養箱水槽等都應納入清潔范圍?？墒褂肕ycoplasma-Off支原體去除噴霧劑或濕巾對實驗臺面和設備表面進行噴灑或擦拭，作用5–10分鐘后再擦拭干凈，并保持通風。培養箱內部處理后應充分通風，若設備支持熱滅活功能，可按廠家說明使用。培養箱水艙應定期更換無菌水，并按規范添加抑菌試劑。  

儲存與分裝要求  

支原體清除劑多為無菌溶液或濃縮試劑，應避免污染和反復凍融。未使用時按說明書溫度保存，常見保存條件為-18℃至-20℃避光；部分即用型產品需2–8℃保存。開封后建議在生物安全柜內無菌分裝，標注日期、批號和用途。配制好的含藥培養基應現配現用，避免長時間放置導致活性下降。  

注意事項  

嚴格按說明書操作：不同產品、不同批次的稀釋倍數、作用時間和適用對象可能不同，不能簡單套用其他品牌用法。  

避免與常規抗生素混用：部分清除試劑本身含有抗菌成分，若與其他抗生素聯用可能影響效果或增加細胞負擔，應以說明書為準。  

密切觀察細胞狀態：清除過程中可能出現細胞生長變慢、貼壁變差或死亡率升高，需根據細胞類型調整處理強度。  

珍貴細胞優先評估風險：對于原代細胞、干細胞、基因編輯細胞株等，清除失敗可能導致進一步損失，應提前制定備份和檢測計劃。  

清除后必須復檢：肉眼無法判斷支原體是否清除干凈，必須使用支原體PCR或qPCR進行驗證。  

僅限科研使用：相關產品通常僅限科研或工業研發用途，不得用于臨床診斷、治療或人體相關應用。  

防止交叉污染：污染細胞應單獨操作，廢液和耗材需經消毒后再丟棄，避免影響其他細胞系。  

建立預防機制：新入庫細胞、復蘇細胞、外購血清和培養基應定期抽檢支原體；長期培養細胞建議每月進行一次常規檢測。